Phosphoproteomik

Norman Langhof April 6, 2016 P 15 0
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Phosphoproteomik ist ein Zweig der Proteomik, die identifiziert, Kataloge und charakterisiert Proteine, die eine Phosphatgruppe als eine post-translationale Modifikation. Die Phosphorylierung ist ein Schlüssel reversible Modifikation, die Proteinfunktion, subzelluläre Lokalisierung, Komplexbildung, Abbau von Proteinen reguliert und damit Zellsignalnetzwerke. Bei all diesen Modifikationen Ergebnisse wird angenommen, dass bis zu 30% aller Proteine ​​phosphoryliert werden, einige mehrmals.

Im Vergleich zu Expressionsanalyse, bietet Phosphoproteomik zwei zusätzliche Informationsebenen. Erstens bietet es Rückschlüsse auf Protein oder Wegs könnte aktiviert werden, da eine Änderung der Phosphorylierungsstatus spiegelt fast immer eine Änderung der Proteinaktivität. Zweitens zeigt es an, was Proteine ​​potentielle Wirkstoffziele wie von der Kinase-Inhibitor Glivec beispielhaft genannt. Während Phosphoproteomik wird erheblich erweitern das Wissen über die Anzahl und Art der Phosphoproteine, ist seine größte Versprechen, die schnelle Analyse von gesamten Phosphorylierung basierte Signalnetzwerke.

Übersicht phosphoproteomic Analyse

Eine Probe Groß phosphoproteomic Analyse beinhaltet

  • Kultivierten Zellen unterziehen SILAC-Codierung.
  • Die Zellen werden mit Faktor des Interesses stimuliert.
  • Stimulation kann für verschiedene Zeitlängen für die zeitliche Analyse auftreten.
  • Zellen werden lysiert und enzymatisch verdaut.
  • Peptide werden unter Verwendung von Ionenaustausch-Chromatographie abgetrennt.
  • Phosphopeptide werden mit phosphospecific Antikörper angereichert, immobilisierte Metall Affinitätschromatographie oder Titandioxid-Chromatographie.
  • Phosphopeptide werden mit Massenspektrometrie analysiert.
  • Peptide sequenziert und analysiert.

Instrumente und Methoden

Die Analyse des gesamten Komplements von phosphorylierten Proteinen in einer Zelle ist sicherlich eine mögliche Option. Dies ist auf die Optimierung der Anreicherungsprotokolle für Phosphoproteine ​​und Phosphopeptiden besser Fraktionierungsverfahren unter Verwendung von Chromatographie und der Verbesserung von Verfahren zur phosphorylierten Resten unter Verwendung von Massenspektrometrie, selektiv zu visualisieren. Obwohl die derzeitigen Verfahren zur phosphoproteomic Analyse stark verbessert werden, gibt es noch Probenverlust und Inkonsistenzen in Bezug auf Herstellung, Anreicherung, und Instrumentierung abzutasten. Bioinformatik und biologischen Sequenzdatenbanken sind auch für Hochdurchsatz-phosphoproteomic Studien notwendig.

Anreicherungsstrategien

Vorherige Verfahren, um phosphorylierte Proteine ​​zu isolieren enthalten radioaktive Markierung mit P-markiertem ATP, gefolgt von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Dünnschichtchromatographie. Diese traditionellen Verfahren sind ineffizient, da es unmöglich ist, große Mengen von Proteinen für die Phosphorylierung Analyse erforderliche erhalten. Daher wird der Strom und einfachste Verfahren zur Anreicherung Phosphoproteine ​​sind Affinitätsreinigung unter Verwendung phosphospecific Antikörper immobilisierte Metall Affinitätschromatographie starken Kationenaustausch-Chromatographie, oder Titandioxid Chromatographie. Antiphosphotyrosinantikörpern haben sich als sehr erfolgreich bei der Reinigung, aber weniger Berichte wurden mit Antikörpern gegen Phosphoserin oder Phosphothreonin-enthaltenden Proteine ​​veröffentlicht. IMAC Anreicherung auf Phosphat Affinität für immobilisierte Metall zum Harz chelatisiert basiert. SCX trennt phosphoryliert aus nicht-phosphorylierten Peptiden basierend auf der negativ geladenen Phosphatgruppe. Titandioxid-Chromatographie ist eine neuere Technik, die deutlich weniger Spalte Vorbereitungszeit erfordert. Viele phosphoproteomic Studien verwenden eine Kombination dieser Anreicherungsstrategien, um das reinste Probe möglich zu erhalten.

Massenspektrometrie-Analyse

Massenspektrometrie ist derzeit die beste Methode, um Paare von Proteinproben angemessen zu vergleichen. Die zwei wichtigsten Verfahren zur Durchführung dieser Aufgabe werden mit isotopen codierten Affinitätsmarkierungen und stabile Isotopen Aminosäuren in Zellkultur. In der ICAT-Verfahren Proben werden einzeln nach der Isolierung mit Massencodierte Reagenzien, die Cystein-Reste zu modifizieren beschriftet. In SILAC werden Zellen getrennt kultiviert in der Gegenwart von verschiedenen isotopenmarkierten Aminosäuren mehrere Zellteilungen ermöglicht zellulären Proteinen, um das Etikett zu übernehmen. Massenspektrometrie wird anschließend verwendet, um Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin-enthaltenden Peptide zu identifizieren.

Phosphoproteomik beim Studium der Signaltransduktion

Intrazelluläre Signaltransduktion wird hauptsächlich durch die reversible Phosphorylierung verschiedener Signal-Moleküle durch Enzyme genannt Kinasen vermittelt. Kinasen übertragen Phosphatgruppen von ATP auf spezifische Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten von Zielmolekülen. Die sich ergebende phosphorylierten Proteins können veränderte Aktivität, subzelluläre Lokalisation oder Tertiärstruktur.

Phosphoproteomic Analysen sind für die Untersuchung der Dynamik von Signalisierungsnetzen. In einem Studiendesign, werden die Zellen zu SILAC Kennzeichnung belichtet und anschließend durch eine spezifische Wachstumsfaktor stimuliert. Die Zellen werden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, und die Lysate werden zur Analyse durch Tandem-MS kombiniert. Dies ermöglicht Experimentatoren, die Phosphorylierung von vielen Phosphoproteine ​​in der Zelle über die Zeit zu verfolgen. Die Fähigkeit, den globalen Phosphorylierungszustand viele Proteine ​​zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen, macht diesen Ansatz viel leistungsfähiger als herkömmliche biochemische Verfahren zum Analysieren von Signalisierungsnetzverhalten.

Eine Studie in der Lage, gleichzeitig messen den fold change in Phosphorylierungszustand von 127 Proteinen zwischen unstimulierten und EphrinB1 stimulierten Zellen. Von diesen 127 Proteine, 40 zeigten eine Zunahme der Phosphorylierung mit Stimulation durch EphrinB1. Die Forscher waren in der Lage, diese Informationen in Kombination mit den zuvor veröffentlichten Daten, um eine Signalübertragungsnetzwerk für die Proteine ​​stromabwärts von der EphB2 Rezeptor zu konstruieren.

Eine weitere aktuelle Studie umfasste phosphoproteomic Groß Identifizierung und Quantifizierung der Phosphorylierung Veranstaltungen des antidiuretischen Hormons Vasopressin in der Niere Sammelkanal ausgelöst. Insgesamt 714 Phosphorylierungsstellen auf 223 einzigartigen Phosphoproteine ​​identifiziert wurden, darunter drei neue Phosphorylierungsstellen in der Vasopressin-sensitive Wasserkanals Aquaporin-2.

Phosphoproteomik bei der Untersuchung von Krebs

Seit der Gründung des Phosphoproteomik, hat die Krebsforschung auf Änderungen an der Phosphoproteom während der Tumorentwicklung. Phosphoproteine ​​könnte Krebsmarker nützlich, um die Krebsdiagnostik und Therapie sein. Tatsächlich hat die Forschung gezeigt, dass es bestimmte Phosphotyrosin Proteome von Brust- und Lebertumoren. Es gibt auch Hinweise auf die Hyperphosphorylierung an Tyrosinreste in Brusttumoren nicht aber in gesundem Gewebe. Befunde wie diese legen nahe, dass es möglich ist, den Tumor Phosphoproteoms für potentielle Biomarker abzubauen.

Zunehmende Datenmengen vor, denen zufolge Scheidungs ​​Phosphoproteine ​​existieren in verschiedenen Tumoren und dass die Phosphorylierung Profilierung könnte die Fingerabdruck Krebs unterschiedlichen Ursprungs verwendet werden. Zusätzlich könnten systematische Katalogisierung von tumorspezifischen Phosphoproteine ​​in individuellen Patienten mehreren verursachenden Spieler während Krebsbildung offenbaren. Durch Korrelieren dieser experimentellen Daten auf die klinischen Daten, wie beispielsweise Arzneimittelreaktion und Krankheitsverlauf, könnten mögliche Krebsmarker zur Diagnose, Prognose, Vorhersage der Arzneimittelreaktion und mögliche Wirkstoffziele zu identifizieren.

Begrenztheit

Während Phosphoproteomik hat stark erweitert Wissen über die Anzahl und die Typen von Phosphoproteinen, zusammen mit ihrer Rolle bei der Signalnetzwerken, gibt es noch einige Einschränkungen auf diese Techniken. Zunächst Isolationsverfahren wie beispielsweise Anti-Phosphotyrosin-Antikörper nicht zwischen Isolieren tyrosinphosphorylierten Proteine ​​und Proteine ​​mit tyrosinphosphorylierten Proteinen unterscheiden. Deshalb, auch wenn Phosphorylierung abhängige Protein-Protein-Wechselwirkungen sind sehr wichtig, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, daß ein durch dieses Verfahren detektiert Protein ist nicht unbedingt eine direkte Substrat nach Tyrosinkinase. Nur durch Verdauen der Proben vor der Immunfällung kann Isolierung von nur Phosphoproteine ​​und zeitlichen Profile der einzelnen phosphorylaiton Websites hergestellt werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass einige relevante Proteine ​​wird wahrscheinlich verfehlt werden, da kein Extraktionsbedingung ist allumfassend. Es ist möglich, dass Proteine ​​mit geringer Stöchiometrie der Phosphorylierung in sehr geringer Menge, oder phosphoryliert als ein Ziel für einen schnellen Abbau verloren.

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