Ribosomen-Display

Jürgen Haack April 6, 2016 R 10 0
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Ribosomen-Display ist eine Technik, die zur in vitro Evolution von Proteinen durchzuführen, um Proteine, die zu einem gewünschten Liganden binden kann. Das Verfahren führt zu translatierten Proteine, die mit ihrer mRNA Vorläufer zugeordnet sind, der verwendet wird, als ein Komplex, um einen immobilisierten Liganden in einem Auswahlschritt binden. Die mRNA-Protein-Hybride, die gut binden, werden dann in cDNA revers transkribiert und deren Reihenfolge über PCR amplifiziert. Das Endergebnis ist eine Nukleotidsequenz, die verwendet werden können, um dicht Bindungsproteine ​​zu erstellen.

Ribosomen-Display-Prozess

Ribosomen-Display beginnt mit einem native Bibliothek von DNA-Sequenzen, die für Polypeptide Ein in vitro Polysom ​​Anzeigesystem Codierung zur Identifizierung von Liganden aus sehr großen Peptidbibliotheken. Proc Natl Acad Sci USA 91, 9022-9026). Jede Sequenz transkribiert wird und dann in vitro translatiert in Polypeptids. Jedoch ist die DNA-Bibliothek nach einer bestimmten Bibliothek von Bindungsproteine ​​kodieren, die genetisch mit einer Spacer-Sequenz fehlt ein Stoppcodon vor seinem Ende fusioniert. Das Fehlen eines Stopcodons verhindert Freisetzungsfaktoren von der Bindung und die Auslösung der Demontage des Translationskomplexes. So bleibt dieses Spacer-Sequenz an die Peptidyl-tRNA befestigt und nimmt die Tunnels auf, und ermöglicht somit das Protein von Interesse aus dem Ribosom herausragen und zu falten. Das Ergebnis ist ein Komplex aus mRNA, Ribosom und Protein, das an der Oberfläche gebundenen Liganden binden kann. Dieser Komplex wird mit dem Absenken der Temperatur und der Zugabe von Kationen wie Mg stabilisiert.

Während der nachfolgenden Bindung oder Panning, Stufen wird der Komplex eingeführt, um oberflächengebundene Liganden. Dies kann verschiedene Weise, beispielsweise unter Verwendung einer Affinitätschromatographie-Säule mit einem Harzbett enthaltenden Liganden durchgeführt werden, dass eine Platte mit 96 Vertiefungen mit immobilisiertem oberflächengebundenen Liganden oder Magnetkügelchen mit dem Liganden beschichtet worden sind. Die Komplexe, die gut binden, immobilisiert. Anschließende Elution der Bindemittel durch hohe Salzkonzentrationen, Chelatbildner oder Mobilliganden-Komplexes mit dem Bindungsmotiv des Proteins erlauben Dissoziation der mRNA. Die mRNA kann dann umgekehrt wieder in cDNA umgeschrieben werden, Mutagenese unterzogen werden, und iterativ in den Prozess mit einer größeren Selektionsdruck, um noch besser zu isolieren Bindemittel zugeführt.

Vorteile der Ribosomen-Display

Dadurch, dass das Protein Vorläufer zum Komplex verbunden, die Prozesse der Ribosomen-Display überspringt die Microarray / Peptid-Perlen / Multiple-gut-Sequenz Trennung, die in Assays, die Nucleotid-Hybridisierungs üblich ist und bietet eine ready Weg, um die Proteine, die binden, ohne Entschlüsselung der zu verstärken Sequenz, bis notwendig. Gleichzeitig setzt diese Methode auf die Generierung von großen, konzentrierten Pools von Sequenzdiversität lückenlos und halten diese Sequenzen aus Erniedrigungen, zu hybridisieren und miteinander reagieren in einer Weise, die Sequenz-Raum Lücken schaffen würde.

Konkurrierende Methoden zur Proteinevolution in vitro sind Phagen-Display, Hefe-Display, bakterielle Display und mRNA display.peptides und Phänotyp. In Ribosomen-Display, ist diese Verbindung während der in vitro-Translation durch die Stabilisierung des Komplexes aus dem Ribosom, die mRNA und die im Entstehen begriffenen, korrekt gefalteten Polypeptid erreicht. Die Ribosomenkomplexe läßt auf der Oberfläche immobilisierten Ziel binden. Wohingegen nicht-gebundene Komplexe weggewaschen kann mRNA von Komplexen Anzeigen eines bindenden Polypeptid gewonnen werden, und somit wird die genetische Information der bindenden Polypeptiden für die Analyse verfügbar.

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